微生物絮凝剂产生菌絮凝活性研究
摘 要：从福州郊区旱田地表土壤中分离得到一株絮凝剂产生菌，根据菌落形态特征，初步鉴定为链球菌。研究表明，培养基组成如下：碳源为蔗糖，氮源为牛肉膏，培养基初始 pH 值为 5 ~ 8.5之间能取得较好的效果，添加一定浓度的 Na+、Mg2 、Ca2 对培养液的絮凝活性有促进作用，而培养液中少量的 Cu2 、Fe3 、Zn2 可抑制絮凝活性，该絮凝剂对高岭土悬浮液有较好的絮凝效果。结合实验现象和双电层理论初步推测了该絮凝剂的絮凝过程模型，对进一步研究微生物絮凝剂的絮凝机理有一定的参考作用。
关键词：微生物 絮凝剂 絮凝活性
微生物絮凝剂是微生物在其代谢过程中分泌的能使液体中不易沉降的固体颗粒凝集，继而沉降的高分子物质。微生物絮凝剂不仅具有传统絮凝剂的特性，因其成分为糖蛋白、多糖、蛋白质、核酸等，具有可生物降解、无二次污染等独特性质，已被应用于高浓度有机废水、粉煤灰、高岭土、泥浆水与印染废水等的处理工艺中，被认为是继无机絮凝剂、有机絮凝剂之后的一种新型的絮凝剂。
微生物絮凝剂研究目前主要集中在微生物的筛选、发酵条件的优化、分离纯化、分子结构的解析、絮凝作用机理、絮凝条件的应用、通过现代基因技术组建工程菌等方面。
本研究报道一株土壤中分离得到的链球菌所产微生物絮凝剂的絮凝特性，并从絮凝剂的产生条件和絮凝条件角度探讨了微生物絮凝剂在不同培养条件和絮凝条件下对高岭土悬浮液的絮凝效果，并尝试根据实验现象结合双电层理论解释提出该絮凝剂的絮凝过程简单模型，对进一步研究微生物絮凝剂的絮凝机理有一定的参考作用。
1 实验材料和方法
1.1 微生物的筛选与分离
取福州近郊旱田黑色地表土作为培养来源。将不同悬浮液在富集培养基中培养至培养液出现浑浊，菌悬浮液划线涂布于固体培养基表面，观察菌落形态为蛋清状的菌落挑取后经斜面培养多次划线分离、初步纯化，直至稀释划线后接连几次培养皿上长出的菌落特征相同，初步认为菌株纯化较完全，编号低温保存。为防止污染，本试验需在净化工作台进行，委托福建省防疫站对菌株进行分类鉴定。
絮凝活性测定：5 g/L的高岭土溶液调节pH后取50 mL至烧杯中，加入0.5 mL接种微生物的发酵液样品，用磁力搅拌器搅拌0.5 min，静止3 min后吸取上层清液于550 nm处测定吸光值B，空白组为液体培养基代替样品测定吸光值A。
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1.2 微生物最适碳源、氮源的筛选
选用不同碳源、氮源在相同的培养条件下进行培养，观察絮凝活性的变化，确定适宜的碳源、氮源。
1.3 絮凝剂的培养条件的优化
研究培养基初始pH、培养温度、不同无机离子种类对絮凝活性的影响，确定产絮凝剂的基本培养条件。
1.4 微生物絮凝剂的絮凝特性
研究絮凝对象中金属离子种类和浓度等对絮凝效果的影响。并依据实验结果推测絮凝过程的简单模型。
2 结果与讨论
从福州旱田土壤中筛选得到一株产絮凝剂微生物，该微生物菌落在培养基平板上有明显的产荚膜微生物形态特点，参见表1。
夹膜或粘液层是某些细菌的细胞表面上产生的一层松散的粘液性物质。荚膜（capsule）具有一定的外形，相对稳定地吸附于细胞壁外；粘液层（slime layer）则无明显的边缘可扩散到周围环境中。细菌荚膜和粘液层的主要成分为多糖、多肽、蛋白质，也有少量为DNA，这些化学成分与已发现的微生物絮凝剂的成分基本一致。本研究所发现的微生物絮凝剂经分离纯化后，主要成分为酸性多糖，详细研究结果另文报道。
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2.1.1 碳源对絮凝活性的影响
以牛肉膏、K2HPO4、少量金属离子为单因子基础培养基，根据可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、乙醇物质中碳元素含量计算应添加碳源质量，以不加碳源为对照，碳源实验结果见表2。
实验表明，不同碳源的选择变化强烈影响絮凝活性。蔗糖作为碳源时培养液表现出最佳的絮凝活性，其次为葡萄糖；可溶性淀粉由于本身的溶解度原因反而使浊度上升，其他如甘油等作为碳源时的絮凝活性小于30%。
2.1.2 培养基中氮源对絮凝活性的影响
以蔗糖，KH2PO4为单因子基础培养基，根据氯化铵、尿素、牛肉膏、硝酸铵、硝酸钠、酵母膏、蛋白胨物质中氮元素含量计算应添加的氮源质量，不加氮源为对照组。实验结果表明：采用了不同的氮源，培养液对高岭土都有一定的絮凝活性（＞50%）。牛肉膏、氯化铵组絮凝活性最高，尿素最低。实验中还发现，菌体的生长与絮凝剂的活性有一定的相关性。菌体生长较好的，絮凝活性也较好；反之则较差。
比较碳源与氮源对絮凝活性的影响发现：碳源变化对絮凝活性的影响大于氮源。这可能是因为微生物所合成的絮凝剂主要依赖于微生物从培养基中的糖类获得，当环境中不存在合成絮凝剂所需要的基本“原料”时，微生物难以有效合成、分泌絮凝活性物质，甚至影响微生物自身的生长。Yokoi等研究发现：Enterbacter sp. 所产生含有蛋白质组分的絮凝剂的絮凝活性受到培养基中氮源的影响较碳源大，这一现象可能与培养基中的氮源参与絮凝剂的微生物合成过程有关。
2.1.3 培养基中金属离子对絮凝活性的影响
在一定离子浓度条件下观察不同离子对培养液絮凝活性的影响。通过实验发现：Cu2+、Fe3+、Zn2+离子的存在对絮凝活性有的较强的抑制作用；而Na+、Mg2+、Ca2+对絮凝活性有促进作用。在培养基中添加无机离子后，发酵培养 1d 后测定培养液絮凝活性，实验结果如图 1。从实验结果来看：培养基中添加 ZnCl2、FeCl3、CuCl2只要达到了 0.1%就将完全抑制絮凝活性的产生。FeCl3的存在使培养基有明显的颜色，使絮凝活性表现为负值；添加 NaCl、MgCl2、CaCl2 使絮凝活性分别提高。考虑到培养液中金属离子对絮凝活性的测定产生干扰，确定培养基基本组成为：碳源 1%、氮源 0.4%、K2HPO40.04%MgSO40.02%、CaCl20.005%。
2.1.4 培养温度对絮凝活性的影响
为确定絮凝剂产生的适宜培养温度，其他条件相同的情况下，分别在不同的温度下发酵培养 1 天，测定絮凝活性。
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从表 4 可以看出微生物在温度 20℃至 40℃条件下培养，所产生的絮凝活性都＞80%，温度为 15℃或高于 40℃时絮凝
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活性迅速下降。根据实验结果，在本实验室条件下培养温度为 30℃。
2.1.5 培养基起始 pH 值对絮凝活性的影响
在不同的 pH 值条件下，30℃发酵培养，并测定絮凝活性。结果见图 2。在培养基起始 pH值为 4 至 9 的范围内微生物都能分泌絮凝活性物质。当 pH 值低于 5.0 或高于 8.5，絮凝活性下降。由于培养基 pH 值约为 5.5，实验中调节培养基 pH 值为 7 后进行培养。
2.1.6 处理对象中金属离子对絮凝活性的影响
EDTA溶液将高岭土充分浸泡，抽滤、洗涤、烘干后配置成 pH = 12 的10g/L 的高岭土悬浮液。在25mL的高岭土溶液中分别加入0.5mL、NaCl、CaCl2、FeCl3溶液，再添加蒸馏水稀释至50mL，使溶液中Na+、Ca2 、Fe3浓度为 2 mmol/L，加入 0.5mL 絮凝剂搅拌后，测定絮凝活性。空白为 EDTA 处理后高岭土悬浮液。
在絮凝体系中添加 Na+、Ca2 能够提高絮凝活性，而加入 Fe3 却使絮凝活性明显下降。对不同 Ca2 离子的进一步研究表明：当体系中 Ca2 浓度为 4 mmol 时絮凝活性最大，继续加大 Ca2 浓度，絮凝活性缓慢下降。Kurane对金属离子对高岭土悬浮液絮凝影响的实验结果表明，加入二价离子能够改善絮凝剂对高岭土悬浮液的絮凝效果，这与本实验的结果一致。
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2.2 微生物絮凝剂絮凝机理的简单模型
一般认为金属离子的助凝作用来源于金属离子对絮凝过程中凝聚作用和絮凝作用的共同参与。高岭土悬浊液中投加金属离子时，高岭土颗粒可在电性中和与压缩双电层作用下，微粒脱稳形成细小的凝聚体。这些细小的凝聚体在絮凝剂的吸附架桥作用下形成大絮体，从而出现沉降。
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但综合本实验和其它相关研究的结果来看，微生物絮凝过程中的一些实验现象无法用压缩双电层理论圆满解释。以下问题有待讨论：
（1）添加二价的离子比添加三价的离子能取得更好的絮凝效果。
（2）过高的 Ca2 离子浓度会使絮凝活性降低。
（3）絮凝剂与金属离子协同促进絮凝的过程。
Yokoi、Salehizadeh、李桂娇都对实验过程中发现的该类现象作出了一些解释。综合本实验结果和其他研究者的研究结论，推测微生物絮凝剂的絮凝过程的可能步骤如下：
（1）溶液中少量金属离子，作为一种“反号离子”，一方面受到悬浮颗粒表面电荷的库仑力作用，聚集、压缩了高岭土颗粒表面的双电层；另一方面受到絮凝剂内部电离基团的作用，被吸附并形成一种可流动的反号离子层。
（2）悬浮颗粒与絮凝剂在热运动中接近，悬浮颗粒表面过剩的负电荷将吸引絮凝剂表面可流动的反号离子向该点移动，此时絮凝剂分子就象一条反号离子的“导管”，反号离子从“导管”中流向悬浮颗粒，中和一部分颗粒表面电荷。
在这一过程中，由于 Fe3 比 Ca2 有较大的正电荷数和较小的离子半径，导致 Fe3 离子在“导管”中流动性下降，无法有效地降低高岭土颗粒表面 zeta 电位。对 Pseudomonas sp.所产絮凝剂的絮凝研究中发现：添加 Fe3 不能有效提高絮凝活性，但电荷数较低的 Fe2 却能有效提高絮凝活性。
（3）由于电荷中和的作用，降低了胶体颗粒表面的 zeta 电位，同时使高分子与颗粒间相互连接。按此步骤高分子能与多个固体颗粒桥连，最后形成大絮体。
当金属离子浓度过高时，一方面颗粒表面聚集了过多的金属离子，导致其表面电荷下降；对于絮凝剂，分子中带负电荷的基团所带电荷与金属阳离子发生电中和，分子内静电排斥作用降低，在溶液中絮凝剂分子不再具有伸展的结构，甚至金属离子可能使絮凝剂也带上了正电荷，出现絮凝活性下降。
这一模型仅初步反映了金属离子对絮凝剂协同作用产生絮凝的过程，没有考虑絮凝剂对颗粒的网捕、吸附等作用，也没有考虑金属离子在溶液中的形态等因素的影响。
3 小结
本实验从微生物菌落的形态入手，快速分离了一株产絮凝剂的微生物；考察并比较了培养基中碳源、氮源对絮凝活性的影响，一定浓度的 Cu2 、Fe3 、Zn2 离子对絮凝活性有抑制作用；Na+、Mg2 、Ca2 对絮凝活性有促进作用；为保证较好的絮凝活性，培养基起始 pH值应控制在 5 ~ 8.5 之间；探讨高岭土溶液中添加的金属阳离子种类和浓度对絮凝活性的影响，并对该微生物絮凝剂絮凝过程模型作了简要的推测。
参考文献：（略）
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