抗生素抗性基因在养殖废水中的分布与去除
导读：畜禽养殖场作为抗生素抗性基因的一个热点区，其产生的废水中存在大量的抗生素抗性基因，直接排放将会污染接受的水体．本研究以微生物固化曝气技术为核心，构建了一个包含沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘的养殖废水处理系统．采用高通量荧光定量PCＲ 技术，探究各种抗性基因在进水、各处理池和出水中的种类、多样性和丰度的变化以及可能的影响因素．研究发现： （ 1） 微生物固化曝气技术能有效降低养殖废水中抗性基因的种类和多样性； （ 2） 该技术也能有效去除养殖废水中抗性基因的绝对丰度，去除率高达93．6%； （ 3） 养殖废水出水中抗性基因绝对丰度仍高于自然水体，其直接排放仍有抗性基因污染风险； （ 4）畜禽养殖废水中TN 和土霉素的含量与许多抗生素抗性基因总丰度存在正相关性．通过对TN 和土霉素的去除或者控制使用，可以有效降低养殖废水中的抗性基因。
抗生素在预防、治疗微生物引起的疾病时具有良好的疗效，同时还能促进畜禽生长，所以被广泛用于畜禽养殖场［1-2］．然而大多数抗生素并不能被动物肠道完全吸收，大部分仍以母体或者相关代谢产物的形式排出体外［2-3］．这些排出体外的抗生素会对环境中的微生物产生一个选择压力，诱导和选择环境微生物产生耐药性，增加环境中抗性基因的丰度和多样性［4］．此外，喂食了抗生素的动物，其肠道内抗性基因的丰度和多样性均有所提高［5］．动物肠道内的耐药菌和抗性基因随着动物的排泄进入环境中，直接增加了环境中抗性基因的丰度及多样性。
抗生素抗性基因是一种新型的环境污染物［3，6］．携带抗生素抗性基因的微生物（ 如致病菌等） 能对相应的抗生素产生耐药性，这使得抗生素在治疗由致病菌引起的疾病时疗效下降甚至无效，严重威胁人类健康［4，7］．2011 年德国爆发“毒黄瓜”事件，在欧洲至少9 个国家蔓延，造成33 人死亡，超过3000 人受到感染，其中至少470 人出现肾功能衰竭并发症，引起本次疫情的就是一种新型的高传染性携带多种抗性基因的致病菌［4］．在美国每年有超过200 万人感染耐药病原体，其中有14000 人死亡［6］。
固化微生物污水净化器（ biocleaner） 是Bio Cleaner 公司研发的由微生物发生器与高效曝气装置组合的污水治理专用设备．对该装置处理养殖废水的研究结果表明： （ 1） 微生物固化曝气技术能有效去除常规污染物，除TP 外，COD 和NH+4 -N 的出水浓度均能达到《畜禽养殖业污染物排放标准》（ GB 18596—2001） ； （ 2） 该技术对抗生素的去除效果依抗生素的种类而变，对4 种四环素类抗生素的去除率高达85%以上； 对大环内酯类中的阿奇霉素的去除率为62．8%； 对大环内酯类中的罗红霉素和氟喹诺酮类抗生素则基本无效［8］。
本研究在之前研究［8］的基础上，采用高通量荧光定量PCＲ 技术，进一步研究： （ 1） 养殖废水中各种抗生素抗性基因在进水、各处理池、出水中的分布与变化； （ 2） 固化曝气技术对各种抗生素抗性基因的去除效果； （ 3） 各种抗性基因的去除效果与常规污染物和抗生素的去除是否有耦合关系。
1 材料与方法（ Materials and Methods）
1．1 系统运行
处理系统采用美国Biocleaner 技术，由沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘组成．各处理单元的尺寸（ 长×宽×高） 分别为： 沉淀池25 m×20 m×5 m、一级处理池25 m×20 m×2 m、二级处理池25 m×20 m×2 m 和氧化塘40 m×30 m×4 m［8］．各处理单元用管道连接，按照高程由高到低，依次排列沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘，省去不同处理单元间依靠泵为动力进行的水力流动．该处理系统废水来自于附近多个养殖场直排的清粪水，每日污水处理量为150—200 t．在一级处理和二级处理池中分别放置一个曝气机和一个Biocleaner 设备，曝气机功率为2．2 kV，采用人工开启电闸控制，运行时间为24 h·d－1 ．Biocleaner 设备装载微生物载体，无需人工维护．系统自2013 年8 月试运行，经过12 个月调试，于2014 年8 月稳定运行．本研究以稳定运行监测数据进行分析。
1．2 样点布设与采样点概况
研究样地位于龙岩市某养殖废水处理示范点．依据处理系统的运行情况，于2014 年8 月，进行1 次系统地采样，采集12 个点，其中进水1 个（ Ⅰ） ，沉淀池2 个（ Ⅱ） ，一级处理池（ Ⅲ） 、二级处理池（ Ⅳ） 和氧化塘（ Ⅴ） 各3 个（ 图1） ．分析测试了12 个点的NH+4 -N、NO－3 -N、TN、TP、COD、TOC、9 种抗生素（ 4 种四环素： 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素； 2 种大环内酯类抗生素： 罗红霉素、阿奇霉素； 3 种氟喹诺酮类抗生素： 氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星） ，研究结果已经发表［8］．本研究选取进水以及各处理单元出水样品（ Ⅰ-1、Ⅱ-2，Ⅲ-2、Ⅳ-3、Ⅴ-3） 进行抗生素抗性基因分析。
1．3 DNA 提取
根据水样的浑浊程度，量取一定体积的水样倒入50 mL 离心管中，12000 r·min－1转速离心10 min，倒掉上清液，在每个离心管中加入1 mL 生理盐水，将底部的沉淀充分混匀．再将样品全部转移至新的1．5 mL离心管中，18000 r·min－1离心5 min 后，倒掉上清液．若所得固体沉淀样品过少，则重复上述操作，直到所得样品约为0． 5 g．然后加入978 μL PBS 缓冲液（ FastDNA SPIN kit for Soil 试剂盒，MPBiomedical，美国） ，并全部转移到试剂盒中的Lysing Matrix E 管，按试剂盒提供的操作说明进行提取．具体步骤如下： 加入122 μL MT Buffer，在FastPrep 仪器中进行振荡破碎均质化（ 时间30 s，速度6．0 m·s－1 ） ，然后对Lysing Matrix E 管进行离心处理（ 14000 r·min－1，15 min） ．将上清液转移到一个新的2 mL离心管中，加入250 μL PPS，并用手摇10 次进行混合．对样品再一次进行离心（ 14000 r·min－1，5 min） ，将上清液转移到一个新的2 mL 离心管中，并加入1 mL Binding Matrix Suspension，用手上下颠倒2 min，使DNA 附着到基质上，静置约3 min．去除约500 μL 上清，分多次将Binding Matrix 全部转移到SPINTM Filter 中，加入500 μL SEWS-M 到SPINTM Filter 中对Binding Matrix 进行清洗，通过离心去除SEWS-M，在室温下风干SPINTM Filter 5 min．最后加入70 μL DES 溶液进行DNA 洗脱。
1．4 高通量荧光定量PCＲ
本实验采用SmartChip Ｒeal-time PCＲ Systems（ WaferGen 公司，美国） 的高通量荧光定量的反应平台［9-11］．总共使用了296 对引物，由于一个基因有多个引物，因此共有214 对抗性基因的引物（ 基本上覆盖目前所有的抗性基因种类） ，5 对可移动原件基因引物和1 对16S rＲNA 基因引物．
反应体系和反应程序与Ouyang 等［11］和黄福义等［12］的一致．采用100 nL 反应体系，各试剂浓度为：LightCycler 480 SYBＲ Green Ⅰ Master Mix 1×，DNA 浓度5 ng·μL－1，BSA 浓度1 ng·μL－1和1 μmol·L－1引物．反应程序为： 95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸30 s，40 个循环； 程序自动升温进行溶解曲线分析．
定量PCＲ 数据处理参照文献进行［11，13］，以CT值31 作为仪器的检测阈值．每个样品进行3 次技术重复，只有当每个样品中3 个重复同时检测出时，才认为目的基因被有效检出．抗性基因相对拷贝数的计算参照公式（ 1） 和（ 2） ［5，11，13］，然后通过16S rＲNA 绝对拷贝数与抗性基因相对拷贝数计算出抗性基因的绝对拷贝数（ 公式3） ．
基因拷贝数= 10（ （ 31－CT） /（ 10/3） ） （ 1）
抗性基因相对拷贝数（ 相对丰度） = 抗性基因拷贝数/16S rＲNA 基因拷贝数（ 2）
抗性基因绝对丰度=抗性基因相对拷贝数×16S rＲNA 基因的绝对拷贝数（ 3）
1．5 16S rＲNA 定量
采用Ｒoche 480 定量PCＲ 仪测定样品中的16S rＲNA 基因，并采用标准质粒外标法对其丰度进行绝对定量［11］．标准质粒原始浓度为1．39×109 copies·μL－1，标准曲线（ 10 倍稀释） 的范围为1．39×103—1．39×109 copies·μL－1 ．使用20 μL 反应体系： 10 μL 2×LightCycler 480 SYBＲ Green Ⅰ Master Mix，上下游引物各1 μL，1 μL DNA 模板和7 μL 无菌水．反应运行程序为： 95 ℃预变性5 min，40 个循环（ 95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s） ，仪器自动添加溶解曲线程序．用灭菌超纯水代替样品进行阴性对照，每个样品均做3 次重复．
1．6 数据处理与分析
平均值以及标准差使用Excel 2007 版本进行计算； 显著性分析和Pearson 相关分析使用SPSS 17．0版本进行分析； 在计算检测到的基因数量时，由于一个基因有多个引物，如果有多对引物检测出同一个基因，在计算时只算检出一个．
2 结果与讨论（ Ｒesults and Discussion）
2．1 抗性基因多样性
在整个处理系统中，所有水样中共检出123 种抗性基因和5 种可移动遗传元件．进水中检测出111 种抗性基因和可移动遗传元件（ MGES） ，沉淀池、一级处理池中均检测出115 种，二级处理池和出水中分别检测出108 种和95 种，比进水（ 111 种） 略有降低（ 图2） ．此外，二级处理池和出水的Shannon 和Inverse Simpson 指数也均低于进水（ 表1） ．这说明微生物固化曝气技术能降低养殖废水中抗性基因的多样性．该出水是直接排入九龙江流域的．在九龙江流域城市河段的2 个水样中，检测出的抗性基因数量分别为131 和161 种［11］．本研究中畜禽养殖废水出水中所检测到的抗性基因种类较少，为90 个．这说明九龙江流域中抗性基因的来源不仅有畜禽养殖废水这一种途径，应该还有来自于城市污水处理厂这一途径。
根据抗性基因对抗生素的抗性机制，可将检测到的抗性基因分为抗生素失活（ antibiotic deactivate） 、抗生素外排（ efflux pump） 、细胞核糖体保护（ cellular protection） 和其他（ unknown） 4 种类型．抗生素失活机制的抗性基因，在各种样品中占46．67% — 50．91%（ 表2） ．黄福义等［12］研究长期施用猪粪的水稻土以及Ouyang 等［11］研究九龙江流域的水体时，也发现抗生素失活机制的抗性基因所占比例最大，分别为：42．59%和49．06%．这说明携带抗生素失活机制基因的微生物是各种环境介质中常见的种类．抗生素外排机制的抗性基因，其检出种类仅次于抗生素失活机制的抗性基因，从进水的30．19%到出水的32．22%．携带抗生素外排抗性基因的细菌，不仅可以将抗生素排出细胞外，还能将重金属和其它有毒分子等排出体外［14］．这使得携带抗生素外排泵抗性基因的微生物能更好地适应环境．
从抗性基因所对应的抗生素类型来看，所检测出的抗性基因覆盖了所划分的9 种类型： 氨基糖苷类抗性基因（ aminoglycoside） 、β-内酰胺类抗性基因（ beta-lactamase） 、氯霉素类抗性基因（ chloramphenicol） 、大环内酯类林肯酰胺类链阳性菌素B 抗性基因（ MLSB） 、多重耐药基因（ multidrug） 、磺胺类抗性基因（ sulfonae） 、四环素类抗性基因（ tetracycline） 、万古霉素抗性基因（ vancomycin） 以及其它类型抗性基因（ others） ．随着污水处理的不断深入，9 种类型的抗性基因数量在各个处理池间无明显差异，在各处理池间所占比例分别为： 17．78%—19．42%、14．15%—17．78%、1．82%—2．22%、12．22%—17．92%、19．81%—21．11%、1．82%—2．22%、12．26%—14．44%、3．64%—5．66%和7．27%—8．18%（ 表2） ．相对而言，多重耐药基因检出种类在各处理单元中所占比例最大．多重耐药基因会使携带其的微生物对多种抗生素具有耐药性，进而有可能使微生物成为“超级细菌”．本研究说明该畜禽养殖废水对人类健康有“超级细菌”的潜在威胁。
2．2 抗性基因丰度
经微生物固化曝气技术处理后，养殖废水中抗性基因绝对丰度显著减少（ 图3） ．进水中抗性基因的绝对丰度为3．8×1010 copies·mL－1，而出水中为2．4×109 copies·mL－1，去除率达93．6%．沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘对抗性基因的去除贡献不一样： 沉淀池中抗性基因绝对丰度为3． 1 ×1010 copies·mL－1，去除率为18．0%； 一级处理池中抗性基因绝对丰度为6．6×109 copies·mL－1，去除率为64．7%； 二级处理池中抗性基因绝对丰度为3．2×109 copies·mL－1，去除率为9．0%； 氧化塘中抗性基因绝对丰度为2．4×109 copies·mL－1，去除率为1．9%．一级处理池对抗性基因去除贡献最大，为64．7%．
抗性基因的相对丰度在各处理池间并没有显著区别（ 图4） ，进水为2．37，出水为3．14．这意味着抗性基因绝对丰度的减少是由于废水中16S rＲNA 绝对丰度（ 或者说微生物数量） 减少所引起的，而不是该处理系统能选择性去除抗生素抗性基因．此外，相对于进水，出水中抗性基因绝对丰度虽然减少了很多，但仍比自然水体高出不少．Ouyang 等［11］研究发现九龙江流经城市的河段水体中抗性基因的绝对丰度为9．7×107—1．0×108 copies·mL－1，发源地河段水体中抗性基因的绝对丰度为7．2×105 copies·mL－1 ．这表明经微生物固化曝气技术处理后，养殖废水中抗生素抗性基因仍有可能对排放的水体产生污染．
随着养殖废水的不断处理，不同抗性机制抗性基因的绝对丰度比例也在发生变化（ 表3） ．携带抗生素失活的抗性基因在各处理池之间无显著变化，进水中为43．2%，出水中为40．4%； 携带细胞核糖体保护的抗性基因在逐步降低，在进水、沉淀池、一级处理池、二级处理池和出水中依次为23．5%、15．6%、6．2%、2．4%和5．3%； 携带外排泵机制的抗性基因在逐步增加，在进水、沉淀池、一级处理池、二级处理池和出水中依次为33．3%、35．6%、48．5%、58．4%和54．2%．这进一步说明，携带外排泵机制的抗性基因的微生物相对于携带其它抗性机制的基因的微生物来说，具有更好的环境适应性．
从抗性基因所对应的抗生素类型来看（ 表3） ： （ 1） 氨基糖苷类抗性基因和四环素类抗性基因在各处理单元中均稳定地占有较高的比例（ 分别为30．4%—40．3%和25．1%—29．9%） ； （ 2） 多重耐药基因虽然检出种类最多，但是它们的绝对丰度在进水中并不是最多的．然而，随着养殖废水的不断处理，其所占比例逐步增加，在进水、沉淀池和一级处理池中依次为： 19．2%、22．5%和26．5%，并在二级处理池（ 34．0%）和出水（ 32．8%） 中超过氨基糖苷类成为污水中丰度最高的抗性基因； （ 3） 虽然大环内酯类林肯酰胺类链阳性菌素B 抗性基因及β-内酰胺类抗性基因在各处理池中检出的数量不少（ 表1） ，但是绝对丰度所占的比例却很少（ 表3） ； （ 4） 在整个处理系统中，万古霉素抗性基因绝对丰度所占的比例最小，在0．01%—0．02%之间，这应该是由于万古霉素抗生素仅用于人类疾病治疗［11］，而生猪养殖行业不使用万古霉素．
2．3 抗性基因与常规污染物、抗生素相关性分析
Forsberg 等［15］研究发现微生物群落组成是土壤抗性基因含量的主要决定因素； Su 等［9］同样发现抗性基因与微生物群落结构显著相关．氮、磷等常规污染物，作为微生物生长繁殖的必要营养物质，可以通过影响微生物的生长，进而影响抗性基因的丰度．将常规污染物浓度［8］与不同抗性机制抗性基因和不同抗生素种类抗性基因的绝对丰度进行相关性分析（ 表4） 发现，TN 与外排泵机制抗性基因、磺胺类抗性基因、四环素类抗性基因和总抗性基因的绝对丰度呈显著正相关（ P＜0．05） ，这说明携带这几类抗性基因的微生物的生长和繁殖受环境中总氮水平的制约．
抗生素滥用被认为是导致环境中抗生素抗性基因急剧增加的主要因素．Looft 等［5］研究发现，抗生素的使用能提高猪肠道内抗生素抗性基因的丰度及多样性； 梁惜梅等［16］也发现，珠江口水产养殖区沉积物中抗生素总浓度与AＲGs 总含量显著相关； Wu 等［17］研究发现四环素类抗生素残余与四环素类抗性基因绝对丰度之间存在显著相关．研究发现土霉素浓度与多种抗性基因（ 氯霉素类抗性基因、大环内酯类林肯酰胺类链阳性菌素B 抗性基因、四环素类抗性基因、细胞核糖体保护机制抗性基因、抗生素外排泵机制抗性基因和总抗性基因） 的绝对丰度均存在显著正相关（ 表4） ； 四环素浓度除与β-内酰胺类抗性基因的绝对丰度存在相关性外，与其它抗性基因间并无显著相关．这表明抗生素对抗性基因的影响因抗生素种类而异．养殖废水中土霉素残留可能是影响养殖废水中抗性基因绝对丰度的重要原因，因此可以通过控制土霉素在养殖场中的使用，有效降低养殖废水中抗性基因的绝对丰度．
3 结论（ Conclusion）
（ 1） 微生物固化曝气技术能有效降低养殖废水中抗性基因的种类和多样性．
（ 2） 该技术也能有效去除养殖废水中的抗生素抗性基因，去除率高达93．6%．沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘对抗性基因的去除贡献分别为18．0%、64．7%、9．0%和1．9%．其中，一级处理池对抗性基因去除贡献最大．
（ 3） 养殖废水出水中抗性基因绝对丰度仍高于自然水体，其直接排放仍有抗性基因污染风险．
（ 4） 畜禽养殖废水中TN 和土霉素的含量与许多抗生素抗性基因总丰度存在正相关性．通过对这两种物质的去除或者控制使用，可能是降低养殖废水中抗性基因丰度的一种有效途径．
作者单位：
上海应用技术大学生态技术与工程学院，上海，201418
中国科学院尘世环境研究所，厦门，361021
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