二甲亚砜在羟自由基检测中的应用
羟自由基（•OH）是一种氧化能力很强的自由基，它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤,使细胞坏死或突变。因此，•OH参与的各种研究已成为医学、生物学、生物化学和环境化学等领域中的重要研究课题。但由于•OH的反应活性大，寿命短，存在浓度低，给有关的研究和测定造成一定难度。目前，通常采用如下方式：电子自旋共振法（ESR）[1]、高效液相色谱法（HPLC）[2]、化学发光法[3]、荧光法[4]、分光光度法[5，6]。这些方法中大多数都采用•OH捕捉剂与其结合生成相对稳定的自由基，用新生成的自由基特性来间接测定•OH的表观生成率。
二甲亚砜（DMSO）为无色透明液体（或结晶），是一种既溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。吸湿性强，无腐蚀、无毒。性质稳定，长时间在沸点温度下加热，微量分解；在碱性状态下可抑制腐蚀或分解。能参与氧化、还原、卤化、脱羧、络合等化学反应，并能起到加速的作用。由于其优良的性能，被广泛应用于医药、农药、石油、化工、有机合成、电子、涂料、冶金、染料和高分子材料等许多化学工业领域。
近年来，国内外均有报道，利用DMSO捕集•OH，定量测定•OH的产率。笔者结合国内外有关文献，对DMSO在•OH检测中的应用作介绍，从而为•OH的进一步研究提供参考。
1 采用DMSO捕集•OH的测定方法
1.1 HPLC
HPLC是一种高效、快速的分离技术，它具有高压、高速、高效和高灵敏度的特点，只需要微升数量级的样品就可以进行全面分析，检测器最小检测量可达10-9～1011 g[7]。测定过程中必须先选择合适的化合物捕集被测体系中的•OH，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱分离与检测的产物，然后用HPLC进行测定。
近几年，DMSO常用来作为捕捉剂，定量测定•OH 的产率。首先使DMSO与•OH反应生成甲基亚磺酸(CH3SOOH)和甲基自由基,然后用重氮盐与甲基亚磺酸反应,生成的重氮化合物利用HPLC测定。其测定原理为：
Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH• （1）
CH3SOCH3+OH•→CH3SOOH+CH3• （2）
O
‖
CH3SOOH+Ar－N=N+→Ar－N=N—S—C3+H+ （3）
‖
O
用坚牢黄GC盐与通过二甲基亚砜捕捉•OH后生成的甲基亚磺酸反应，将生成的邻-氯苯重氮甲基砜用乙酸乙酯萃取，然后用HPLC定量地测定了Fenton反应体系中产生的•OH。以Capcell-Pak NH2为流动柱，乙醇与正己烷混合液(3∶100，体积比)为流动相分离，流速为1 mL/min；检测器为Shimadzu SPD-10AV紫外－可见分光光度计，C-R6A积分议；检测波长为285 nm；进样：20 μL/次。RAO等[8]等用DMSO作捕捉剂，在甲硫氨酸或催化酶的作用下，与•OH作用生成甲基亚磺酸。使用Radical-Pak C18柱，以5%甲醇为流动相(流速2 mL/min)进行分离，在214、240 nm波长下检测，检测限为50 ng •OOH和200 ng •OH。GAMOH等[9]用DMSO捕获•OH生成甲基亚磺酸，再同坚牢蓝BB盐反应生成偶氮砜。在40 ℃，STR-ODSⅡ柱，80%乙腈作流动相分离，420 nm检测，线性范围达到0.01 mol/L。比较了几种重氮盐与甲基亚磺酸的反应产物通过HPLC的测定结果（见表1）。相比较而言，坚牢黄GC盐与甲基亚磺酸反应产物的信号不但出现尖锐的单峰，且峰高不受Fe2+等离子的影响[10]。
表1 几种重氮盐与甲基亚磺酸的反应产物通过HPLC的测定结果
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1.2 荧光法
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法。该法具有灵敏度高，选择性强，需样量少和方法简便等优点。它的测定下限通常比光度法低2～4个数量级，应用非常广泛。近年来，DMSO作为•OH的探针试剂引起了人们的关注。杨小峰等[11]使•OH先与DMSO反应, 定量生成甲基自由基, 然后甲基自由基被自旋标记荧光探针I捕捉, 形成强荧光产物, 荧光强度的增量（ΔF）与反应生成的甲基自由基的量成正比，也与参加反应的•OH的量成正比。基于上述原理建立的表征•OH的实验方法，具有操作简单、专一性好、灵敏度较高和易于推广等特点，可用于化学与生物体系中•OH 的表征。谷学新等[12]采用Fenton体系产生•OH与DMSO反应产生甲醛，然后与乙酰丙酮、氨发生Hantzsch反应生成的3，5-二乙酰-1，4-二氢吡啶，其最大激发波长和发射波长分别为419.4、505.5 nm，通过测定荧光强度的变化可以间接定量羟基自由基的产生量。TAI等[13]利用DMSO和•OH反应生成定量的甲醛这一反应，再用氨和1，3-环己二烯聚酯在pH为4.5的条件下和甲醛反应，产生荧光吸收在400.4、452.3 nm的物质，通过测定荧光的大小，即可判断羟基自由基的量。
1.3 比色法
比色法作为一种定量分析的方法，最早开始于19世纪30～40年代，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。该法简便实用，费用低廉，操作简单，易为一般实验室所用。宋艳等[14]采用Fenton体系产生•OH与DMSO反应产生甲醛，再与2，4-二硝基苯肼(DNPH)反应生成稳定的酒红色腙类物质(HCHO-DNPH)，其最大吸收波长为390 nm，光度法测定其含量可间接测定•OH的生成量。徐向荣等[15]利用Fenton反应产生的•OH与DMSO反应，生成甲基亚磺酸，再与坚牢蓝BB盐反应生成偶氮砜，比色法测定其含量可间接测定OH•的生成量。
1.4 其他方法
DMSO常被用作•OH的捕获剂，其优点是它对大部分的生物体系具有较高的容忍度以及对•OH有较好的灵敏度。TAKESHITA等[19]用DMSO来捕获大鼠体内通过X-射线产生的•OH，生成甲基自由基，再以PBN（苯基叔丁基氮氧化合物）捕获甲基自由基，通过电子顺磁共振（EPR）间接检测•OH的含量，该结果为研究人类受辐射伤害的程度提供了一定的参考。杨青等[17]报道了Fenton反应产生的轻自由基氧化DMSO，生成的甲醛与乙酞乙酸乙酷和氨发生Hantzsch反应，反应产物3，5-二乙氧基碳基-2，6一二甲基-1，4一二氢吡啶在－1.09 V(SCE)处有一灵敏的二阶导数极谱峰，通过峰电流变化可间接测定•OH。VULCANO等[18]研究表明，DMSO在捕捉生理产生的•OH时，对TNF-a的抑制作用相对较小，具有较好的捕捉效果。还可以将•OH与二甲基亚砜反应产生甲烷，应用气相色谱仪检测所生成的甲烷，判断该反应体系有无•OH生成以及测定•OH的相对含量。但是，气相色谱法测定•OH存在专一性问题，而且灵敏度和重复性较差。
2 结语
随着人们对环境问题的重视，高级氧化技术以其高效、快速、无二次污染等众多优点而成为环境污染治理的一个重要方法，而羟基自由基的定量、在线、准确检测是研究高级氧化反应机制的重要手段与工具。DMSO由于其优良的特性，常被用来作为•OH的捕捉剂，定量测定•OH产率。相信随着该研究领域的进一步深入，DMSO在•OH检测中的应用会越来越广泛。
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