推流式固定化絮体生物反应器培养ANAMMOX菌试验研究
1 ANANMMOX工艺研究状况
厌氧氨氧化技术的研究从荷兰KLUYVER试验室发现这一实验现象（1），到2002年6月世界上第一座生产性装置在DOKHAVEN投入运行（2），至今已持续近十年。国内的一些研究者在这一领域也取得了一定的研究成果（3）。目前国内一大批研究机构正积极地在这一领域开展研究工作（4）。综观目前的研究成果，对ANAMMOX 的基础理论研究已经相当深入，但对如何快速培养和富集ANAMMOX菌公开报道，较为鲜见。众多研究者缺乏研究材料的问题相当普遍，这已成为在这一领域开展大量研究工作的重要瓶颈。
2 ANAMMOX菌培养反应器选择
目前已知的培养ANANMMOX菌方法的有两类，一类是采用ANAMMOX菌接种物，在反应器中进行增殖培养；另一种是采用活性污泥进行富集培养。荷兰代尔夫特工业大学（TU Delft）关于ANAMMOX的研究主要利用第一种方法，种泥来自于最早发现ANAMMOX现象的脱氮流化床反应器。在国内开展的研究只能依靠从活性污泥中富集培养的方法。浙江大学郑平、胡宝兰等采用UASB反应器成功地富集到了高活性的ANAMMOX污泥（5）。上海交通大学的杨虹等采用悬浮填料床反应器，成功地进行了OLAND工艺的研究，该工艺中同样有ANAMMOX菌参与反应（6）。荷兰研究者认为SBR是适合ANAMMOX 菌培养的反应器，并且在该反应器中培养出了颗粒化的ANAMMOX污泥（7），但是该反应器全套购置费用昂贵，国内一般研究机构难以承受，不便于推广使用。分析目前关于ANAMMOX菌的研究成果可知，培养该菌应该满足其如下一些基本要求：
（1） 该菌广泛地存在于自然界中，在具有硝化、脱氮能力的生物膜、长污泥龄低负荷活性污泥中数量较多。
（2） 该菌在有氨氮、亚硝酸盐氮的环境中，可以进行ANAMMOX反应，并能够增殖。
（3） 氧对该菌完成ANAMMOX反应有抑制作用（8）。
（4） 该菌的合适生存环境是：温度20-43℃，pH6.7~8.3（9）。
（5） 亚硝酸盐氮抑制浓度为100mg/L（9）。
（6） 该菌的倍增时间是4-11天，合成系数是0.054gVSS/gNH4+-N，污泥衰减系数为0.01d-1。 比增长速率为0.065 d-1（10）。
目前研究中使用的反应器，如UASB，流化床，填料床等，基本属于完全混合类反应器。采用推流式的反应器，并且将启动污泥均匀地固定在反应器中，同样适合于ANAMMOX 菌的富集培养。理由如下：
（1） 接种污泥中含有少量ANAMMOX菌，这些分散于污泥絮体中的菌体通过填料的支撑作用，均匀地固定在反应器中，可以获得相对稳定、相互依存的生长环境。
（2） 培养基质低速穿过污泥絮体，可以为该菌提供营养，传递中间产物。
（3） 反应器中基质浓度沿推流沿程上是递减分布的，为污泥在各种负荷下生长提供了可能性，在进水口附近是高负荷区，在出水附近是低负荷区。负荷的不同，微生物的生长状况也呈现出差异，特别是对于复合菌而言，不同种类的菌在反应器中可能有相应的生长区段。
（4） 对于氧、高基质浓度等抑制因素，推流式反应器的前段可以起到保护后段的作用。
（5） 从推流沿程上取样，可以方便观察不同区段微生物的生长和基质浓度变化所带来的差异性情况。
（6） 从设备要求上讲，该反应器只需要一个进水泵，最大限度低减少了转动部件，从而对保证系统的密闭性非常有利。整个系统造价低廉。
基于上述设想，本研究设计了一个2.4L的推流式固定化生物絮体反应器，在4个月内成功地完成了启动过程。随后启动的另一组12L反应器也已获得了稳定的ANAMMOX活性。
3 试验装置及方法
3.1 试验装置
试验用ANAMMOX反应器及试验流程图见图1.反应器有效容积为2.4L。该装置运行在30℃的恒温试验室中。进水流量范围0.8~1.13L/d，平均流量为0.923L，平均水力停留时间为2.6天。
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1．进水贮瓶 2. 水蠕动泵 3. 流式固定化絮体反应器 4. 出水贮瓶 5. 出水贮瓶
图1 ANAMMOX反应器及试验流程图
3.2 接种污泥
接种污泥取自某污水厂的好氧消化污泥和中水处理厂的好氧污泥，经过短暂的硝化培养后，作为接种污泥使用。其部分理化性状为：TS 13.3g/L; VS 7.25g/L; VS/TS 54.65%; pH 8.0~ 8.3。
3.3 培养基质
含氮污水采用在自来水中配入工业碳酸氢铵和亚硝酸钠的方法配制，同时按照一定比例加入无机盐和微量元素(3)。每次配制基质后，用氩气置换20-~30分钟，在进料过程中也连续通入该气体，以消除氧的影响。
3.4 分析方法
氨氮：纳氏试剂光度法；
亚硝酸盐：N-( 1-萘基)乙二胺光度法；
硝酸盐：紫外分光光度法；
总氮：过硫酸钾氧化-紫外分光光度法；
PH：玻璃电极法；
碱度：电位滴定法；
每批次分析化验时，每个项目均选取一个样品进行加标回收测定，回收率在90%以上为有效数据。
4 推流式固定化絮体生物反应器的启动与运行结果
试验期间氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮和反应器负荷的历时变化曲线见图2~6。
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4.1 污泥适应及转换期
污泥接种完毕后，开始连续进水培养ANAMMOX 菌。根据郑平等的经验，起始浓度设定为70mg/L(NH4+-N和NO2--N)。试验开始的一个半月可以看作是污泥的适应和转换期。接种污泥均是好氧污泥，并且含有一定的有机物，在转为厌氧状态下运行，有一个转变过程。从图1-5中可以看出，出水中NH4+-N、NO2--N、TN变化非常不稳定。根据碱度变化和各种氮形态之间转化分析，这一时期首先发生的是氨氧化和反硝化反应，然后才开始ANAMMOX反应。从第30天以后后，氨氮浓度持续降低，亚硝酸盐氮浓度持续上升浓度，但是氨氮转化量高于亚硝酸盐氮增加量，总氮去除率均小于20%。到第45天后，亚硝酸盐氮浓度开始逐步下降，并低于进水浓度，同时总氮去除率上升，达到30%以上。出水中的硝酸盐氮含量和产气量开始上升。至此反应器已经具备一定的ANAMMOX反应特征。
4.2 负荷提高期
从第45天后开始提高负荷，考虑到反应器中要发生一部分氨氧化反应，有一部分氨氮要转化为亚硝酸盐氮，因此在配水时，有意提高氨氮浓度（一般按氨氮与亚硝酸盐氮1.2~1.5:1的比例配置，根据出水中残余的氨氮和亚硝酸盐氮浓度进行调整）。从图1-4中可以看出，到第80天后，总氮的去除率达到80%，出水中的氨氮和亚硝酸盐氮均接近0mg/l。反应器此时已基本稳定，第80天以后按照7-10天提高进水TN60-80mg/l的速度提高负荷，控制出水中氨氮和亚硝酸盐氮均接近0mg/l。到120天左右，在反应器中观察到了红色的颗粒状污泥，此污泥可能就是ANAMMOX菌的聚集体。试验结果表明，虽然进水浓度在不但提高，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率均接近100%，但总氮的去除率因为有硝酸盐氮的生成，而始终维持在80%左右。当负荷降低时，硝酸盐氮的浓度可以降低，总氮去除率也随着上升，但为了加快培养细菌，未在这方面进行进一步试验。在本试验第135~147天的12天稳定运行期内（平均流量0.929L/d），平均进水氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮浓度分别为337.0mg/l、317.4mg/l，27.3mg/l，684.8mg/l，出水中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮的浓度分别为5.2mg/l, 6.4mg/l, 111.4mg/l、128.2mg/l。反应器平均进水氨氮、亚硝酸盐氮、总氮负荷分别为0.131Kg-N/m3.d，0.123Kg-N/m3.d，0.265Kg-N/m3.d，反应器平均氨氮、亚硝酸盐氮，总氮去除负荷分别为0.129Kg-N/m3.d，0.120Kg-N/m3.d，0.215Kg-N/m3.d，平均去除率分别为98.4%，97.9%，81.1%。目前反应器运行负荷仍在不断提高之中。
5 污泥性状观察
5.1 反应器沿程污泥分布
经过连续培养，反应器中污泥颜色变化不大，从原来的黄褐色变为较暗的土黄色。反应器前半部分的污泥变少，反应器后半部分的污泥从外观观察未见减少。试验过程中未观察到明显的污泥流动和流失现象。
5.2 污泥颗粒化
从第120天观察到反应器前半部分出现红色污泥后，红色污泥颗粒在填料支架上成片生长，污泥的数量和尺寸在不断增加。并且与黄色絮状污泥混杂在一起。颗粒尺寸从0.2mm到3-4mm不等。污泥颗粒周围有较多气泡。反应器的后半部分未发现红色污泥。这表明高负荷有利于该污泥的生长和颗粒化。由于反应器是推流式运行，到末端可供微生物利用的基质较少，不利于微生物的大量生长。
6 问题讨论
6.1 氨氮与亚硝酸氮反应比例问题
本试验中观察到的氨氮和亚硝酸盐氮反应比例与目前普遍认同的反应方程式（式1）(10)有较大差异。
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根据上述反应式，氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的反应比例为1:1.32:0.26左右，胡宝兰等的试验结果是1:1.123（氨氮：亚硝酸盐氮）。本试验期间反应器累积的氨氮与亚硝酸盐氮反应比例为1.37:1:0.056（或1:0.73:0.04）。初步探索性试验表明，硝酸盐氮的比例可以通过降低负荷进一步降低，但如果将进水氨氮与亚硝酸盐氮浓度改为1:1，对反应器的运行将造成重大冲击。本反应器中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮反应比例的差异是否是由于存在硝化反应或存在其他微生物反应所造成，仍有待于以后的试验深入研究确认。
6.2 负荷提高速度问题
负荷提高速度受污泥增长的速度的限制。本试验期间，按照7~10天增加总氮浓度60-80mg/L的速度提高负荷，基本上与反应器中微生物的增长相适应。当负荷提高过快或提高幅度过大后，会导致出水中有残余的氨氮和亚硝酸盐氮。虽然维持一定出水基质浓度对反应器末端微生物的生长有利，但由于对ANAMMOX 反应器的控制条件不甚明了，为了保证反应器的稳定运行，只好按控制出水亚硝酸盐氮和氨氮浓度均为0mg/L的方式运行。
7 氧气的影响
反应器氧非常敏感，少量的氧进入反应器就会造成ANAMMOX反应效率的急速降低，出水pH也较原先的值低。可以通过观察出水pH的变化，判断反应器是否受到氧的影响。氧对反应器的影响是可逆的，并且可以通入氩气驱赶氧气，消除氧对ANAMMOX反应的抑制。
8 运行控制方法
本试验运行结果表明，控制出水氨氮、亚硝酸盐氮浓度在一定的范围内，稳定运行7-10天作为一个周期，再提高负荷；利用出水pH、碱度的变化判断反应器日常的运行情况，就可以顺利地运行该反应器，并获得ANAMMOX活性和颗粒化的ANAMMOX污泥。由于试验装置一般较小，产气计量较为困难，不便于作为运行控制手段。
9 结论
（1） 采用推流式固定化絮体生物反应器培养ANAMMOX菌，有其独特的优势，是一种廉价并且易于控制的试验手段。
（2） 本试验利用该反应器成功地在一个半月后获得了稳定的ANAMMOX活性，并且在120天左右培养出了红色的颗粒化污泥（可能是ANAMMOX菌的聚集体）。
（3） 本试验运行后期的稳定运行期间，反应器平均HRT为2.58天，温度为30度时获得如下结果：平均进水氨氮、亚硝酸盐氮浓度分别为337.0mg/l、317.4mg/l，平均出水氨氮、亚硝酸盐氮浓度为5.2mg/l、6.4mg/l，平均出水硝酸盐氮浓度111.4mg/l；氨氮、亚硝酸盐氮、总氮去除率分别为98.4、97.9%、81.1%；氨氮、亚硝酸盐氮、总氮的去除负荷分别为0.129Kg/m3.d、0.120Kg/m3.d、0.215Kg/m3.d。
（4） 该反应器可以通过控制出水氨氮、亚硝酸盐氮浓度，日常监控pH、碱度等指标的方式运行管理。
参考文献
1. Mulder, et al. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor. FEMS Microbiology Ecology. 1995, 16:177~184，ELSEVIER
3．郑平等,厌氧氨氧化电子受体的研究，应用与环境生物学报，1998，4(1):74~76
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5．胡宝兰等，新型生物脱氮技术的工艺研究，应用与环境生物学报，1999，5(suppl):68~73
6．杨虹等，全程自养脱氨新技术处理污泥脱水液的研究，环境科学，2001，Vol22，No5.
7．M. Strous, J.J.Heijnen, J.G.Kuenen. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammomium-oxidizing microorganisms. Applied Microbiol Biotechnol (1998) 50:589-596 ,Springer-Verlag ,1998
8．Marc Strous, Eric van Gerven, J.Gijs Kuenen, Mike Jetten. Effect of aerobic and Microaerobic conditions on anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) sludge. Apply and Environmental Microbiology, June 1997, Vol63,No 2
9．Marc strous, J.gijs Kuenen, Mike S. M. Jetten. Key physiology of anaerobic ammonium oxidation. Applied and environmental microbiology, July 1999, Vol65,No.7
10．Clair N. Sawyer, Perry L. McCarty, Gene F. Parkin, Chemistry for Environmental Engineering(fourth edition) 环境工程化学（第4版），清华大学出版社，2002。
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