磁性微球在环境监测中的应用
摘要：磁性微球是以金属或金属氧化物为核，外面包被一层具有生化活性基团高分子膜的一种功能材料。文章介绍了磁性微球在细胞分离与标记、免疫分析、固定化酶以及环境监测领域中的应用。其中，重点介绍了磁性微球在环境监测工作中用于分离水体中极微量的微生物和其它有机物，并和酶联免疫分析法（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、荧光免疫分析（FIA）、电化学发光检测技术（ECL）等检验技术相结合，使检测灵敏度和检测效率得到大幅提升。同时，还对磁性微球在这个领域的应用前景进行了展望。
关键词：磁性微球 环境监测 痕量分析
1前言
磁性微球是由SenyeiAE在1978年首先研制出来的一种新型的功能材料。它的内部是一个磁核，因而在外部磁场的作用下,微球可以定向移动；外部是一层高分子层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联，进而在磁场的作用下实现分离。
磁性微球从诞生开始，它就受到了科研工作者的关注，并且在生化分析领域得到成功的应用。近年来，将磁性微球包被上特异性抗体、受体、单链DNA，用于分离复杂样品中的靶体，取得巨大成功。与传统的分离方法相比，把磁性微球用于复杂组分的生化样品的分离，能够实现分离和富集同时进行，大大提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提高。目前，这种磁性微球已被广泛应用于免疫分析、核酸分析、细胞分离、酶的固定等多个领域。最近，已经有相关的文章报道了将磁性微球应用于检测环境样品中的痕量微生物或者某些活性化学物质，取得了很好的效果。
2磁性微球的种类与特点
磁性微球按其制备时所用的材料的不同，通常可分为无机微球、生物高分子微球、聚合物高分子微球等。由于通过单体聚合得到的磁性微球能够人为方便地控制微球粒径和表面活性基团的种类，因此，聚合物微球是目前人们研究较多的一种。通过单体共聚反应可以得到醛基微球、氨基微球、羧基微球、羟基微球等。具有不同官能团的磁性微球可以用于分离不同的生化样品。
一般地，用于生化分析的磁性微球必须满足以下条件：(1)超强的顺磁性，就是指在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象；(2)合适的粒径且粒径分布范围窄，使微球有足够强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降；(3)具有丰富的表面活性基团，以便微球可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
3磁性微球的应用
3.1细胞分离与标记
利用磁性微球进行细胞分离的一般过程是：将抗细胞表面特异性抗体包被磁球表面，与细胞原液混合孵育、磁分离，然后用适当方法解离，并将磁球分离出来，得到纯净的细胞[1]。磁性微球在应用于细胞分离时，通过选择表面特异性抗体的不同，既可以用于分离不需要的细胞（反向分离），也可用于富集所需要的细胞（正相分离）。Treleaven等[2]将苯乙烯微球与单克隆抗体结合，然后注入被癌细胞浸润的骨髓中，孵育一段时间后进行磁分离，可以将骨髓中的癌细胞分离出来。张津辉等[3]用磁性微球分离检测水中致病细菌，取得较满意的效果。磁性免疫微球还被用于分离幽门螺杆菌或其它有机物，进行PCR检测，其敏感度大为提高[4]。
3.2固定化酶
酶是一种生物蛋白质，目前常用的酶分离方法存在的问题是酶在分离后很容易失活，影响到它的催化活性。用磁性微球分离酶可以很好地保持它的活性和稳定性，同时也使得体系中酶的回收更加方便，提高了酶的使用效率。国内邱广明等[5]采用碳化二亚胺法在磁性微球表面固定中性蛋白酶，制备活性高达700U/g；缓冲溶液pH6.0、离子强度较高时，固定化酶的活性最高。邱广亮等[6]通过研究合成了具有磁响应性聚乙二醇微球，并以此为载体，固定化了a-淀粉酶。在最适条件下，固定化酶的活性达34000U/g(干胶)，并且该固定化酶对酸、碱、热的稳定性大大增强，其操作稳定性也大大增加。
3.3免疫分析
将磁性微球表面包被特异性抗体，就可以和待测样品中抗原发生免疫反应，用磁铁就可以将微球和样品基质分离，然后将吸附抗体和抗原的磁性微球用荧光免疫检测法或电化学发光检测法检测。该过程使免疫分离与富集结合为一体，提高了分析检测的灵敏度，同时避免了分析过程对人的可能危害。Nakamura等[7]把细菌磁微球用于检测血清中免疫球蛋白IgG的含量，其线性范围为0.5～100ng/mL。Kawasaki等[8]研究采用细菌磁性微球酶联免疫化学发光快速高灵敏度检测鼠抗IgG，完成一个样品的检测需时10min，线性范围为1～105fg/mL。Fabregas等[9]将磁性免疫微球用磁场固定在一个平板换能器上，制得一种新型免疫传感器，并将其应用于流动分析系统，完成一个测定循环需时小于30min，能够检测出样品中微摩尔级浓度的兔抗IgG。
4环境方面的应用
鉴于磁性微球强大的功能特点以及在生化领域所取得的成功应用，科研工作者已经尝试将磁性微球引入环境监测领域，用于对环境中自然水体、工业废水、生活污水、土壤环境中部分有毒有机物、病毒、细菌的检测。此外，将磁性微球应用于环境污染处理，如废水处理，将是环境治理中另一个崭新的领域。
4.1水体或环境中微生物的检测
地表水或者各种污水中成分非常复杂，除了可见的各种残渣、碎片、油脂、泡沫、漂浮物之外，里面还含有多种微生物。当水体中这些微生物含量超过正常指标，必将造成大范围的疾病流行，对人类的身体健康造成严重的威胁。因此，对自然水体、各类污水、土壤中各种微生物的种类及含量的监测是环境监测工作中的一个重要课题。我们通常采用的检测污水或其它水体中微生物含量的方法都需要将采集到的样品进行预处理，除去样品中的各种悬浮物。这一步非常费时，同时，样品中待检测组分会随预处理过程部分丧失，使最终检测结果发生偏差。采用免疫磁性微球分离技术可以将环境样品中目标微生物很快分离出来。将磁性免疫微球分离技术和其它检验方法相结合，如和ELISA、PCR、FIA、ECL等技术相结合，可以将检测效率和检测下限大幅提高。
用磁性微球检测水体中微生物含量的一般过程是：把包被有特异性抗体的磁性微球和待测样品混合孵育一段时间后，在磁场的作用下分离，可以方便地将待检测的一种或多种微生物分离出来，然后用ELISA、FIA、ECL等检测方法进行检测。Yu.H[10]成功地将磁性免疫微球应用于快速分离环境水体中的细菌和毒素，并将这种分离技术和荧光免疫分析法相结合，能够快速探测出环境水体中2×10-3个/mL的E.coliO157，并能够在完成96个/h样品的检测。SylvieHallier-Soulier等[11]研究用磁性免疫微球富集环境水体中的似隐菌属担孢子（一种能够引起肠胃疾病的原生动物），然后采用PCR扩增检测技术进行检测，其检测灵敏度达到能够从每
4.2水中有机物的检测
目前常用的检测水体中有机物含量的方法是气相色谱法或高效液相色谱法。尽管色谱法的检测灵敏度很高，但是色谱柱对被检测样品的要求非常高，否则会影响检测的灵敏度和色谱柱的使用寿命。因此，废水在用色谱法检测之前，需要经过烦琐的预处理，除去样品中容易对色谱柱产生污染的成分。色谱柱完成一个样品的分析只需20min，而样品的预处理需要几小时，甚至几天。因此用色谱法分析废水样品的工作量非常大。
利用磁性微球分离效率很高的特点，将微球应用于废水中特定组分的分离、检测，可以有效地减少工作量，缩短工作时间。其过程是将富含活性基团-NH2、-COOH、-CHO等的磁性微球和待测样品（必须含有-NH2、-COOH、-CHO等活性基团）混合，在活性试剂的作用下，样品中的待测物质就偶联富集到磁球的表面，接着用磁场分离出来进行检测。检测方法可以用电化学检测法、发光检测法或电化学石英晶体微天平等方法。兰州大学力虎林[12]做了用磁性微球分离检测废水中痕量肼的研究。他们将带羰基的微球加入含肼的废水中，并在沸水中加热20min，然后用磁性电极吸附分离，在HOAc-NaOAc缓冲溶液中用脉冲伏安法测定，获得很好的检测效果，其最低检测限为0.1mg/L。杨明等[13]研究用含酰肼基团的磁性微球吸收富集水中的微量甲醛，在弱酸性环境中，磁性微球上的酰肼基团和甲醛反应生成具有电活性的物质腙。在测定时，磁性微球聚集在磁性电极的表面，电活性物质在-1.04V被还原，利用还原峰电流值可以测量甲醛的含量。用这种方法测定环境水样中甲醛的含量，其检测下限为0.2mg/L，检测灵敏度要比常规的光度法、色谱法、电化学法等检测方法高。其它具有能够和磁球偶联的活性基团且有电活性的物质，如含有醛基、羰基、氨基等的有机物都能用这种方法检测。
5结论与展望
磁性微球作为一种新型的功能材料，在生命科学、生化领域中的应用非常广泛，但是有关微球在环境科学领域应用的报道还非常少。因此，磁性微球在环境领域中的应用还是一个崭新的研究方向。由于磁性微球具有很大的比表面积，且表面分布着丰富的活性基团，可以和具有生物活性成分以及带有活性基团的有机物发生偶联，再加上磁性微球易于分离的特点，使得待检测样品中痕量组分高效地分离富集起来，提高了分析检测灵敏度。此外，如果将磁性微球和某些特定的催化剂相结合，应用于废水处理，也可能会收到意想不到的效果。因此，我们有理由相信，随着研究工作的深入，磁性微球将在环境监测以及环境管理工作中发挥重要作用。
6参考文献
1兰小鹏．磁性微球在生物医学上应用的新进展．国外医学临床生物化学与检验学分册，1993,14(4)：158~161．
2TreleavenJG,GibsonFM,UgelstadJ.Removeofneuroblastomacellsfrombonemarrowwithmonoclonalantibodiesconjugatedtomagneticmicrospheres.Lancet,1984,14(1):70~75.
3张津辉，廖莎，李凤义，等．磁性亲和分离的实验研究．军事医学科学院院刊，1998,22(2)：107~109．
4EnrothH,EngstrandL.ImmunomagneticseparationandPCRfordetectionofHelicobacterPyloriinwaterandstoolspecimens.J.Clin.Microbiol.,1995,33:2162~2168.
5邱广明，孙宗华．磁性高分子微球共价结合中性蛋白酶．生物医学工程学杂志，1995,12(3)：209~213．
6邱广亮，张艳茹．磁性载体用于酶固定化方面的研究．内蒙古师范大学学报，1998,27(2)：129~133．
7NakamuraN,HashimotoK,MatsunagaT.ImmunoassaymethodforthedeterminationofimmunoglobulinGusingbacterialmagneticparticles.Anal.Chem.,1991,63(3):268~272.
8TadashiMatsunaga,MasashiKawasaki,XieYu,etal.Chemiluminescenceenzymeimmunoassayusingbacterialmagneticparticles.Anal.Chem.,1996,68:3551~3554.
9SilviaSole,SalvadorAlegret,FranciscoCespedes,etal.Flowinjectionimmunoanalysisbasedonamagnetoimmunosensorsystem.Anal.Chem.,1998,70:1462~1467.
10YuH.Useofanimmunomagneticseparation-fluorescentimmunoassay(IMS-FIA)forrapidandhighthroughputanalysisofenvironmentalwatersamples.Anal.Chim.Acta,1998,376:77～81.
11SylvieHallier-Soulier,EmmanuelleGuillot.Animmunomagneticseparationpolymerasechainreactionassayforrapidandultra-sensitivedetectionofCryptosporidiumparvumindrinkingwater.FEMSMicrobiologyLetters,1999,176:285～289.
12MingYang,HulingLi.Determinationoftracehydrazinebydifferentialpulsevoltammetryusingmagneticmicrospheres.Talanta,2001,55:479~484.
13杨明，力虎林．磁性微球在测定水中痕量甲醛中的应用．兰州大学学报,2001,37(6)：47～50．
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